Language
Экзон
ДомДом > Блог > Экзон
ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ

Экзон

Jul 10, 2023

Научные отчеты, том 6, Номер статьи: 18741 (2016) Цитировать эту статью

2131 Доступов

6 цитат

3 Альтметрика

Подробности о метриках

Исправление к этой статье было опубликовано 9 мая.

Эта статья обновлена

ATM является важным геном предрасположенности к раку, который кодирует критическую апикальную киназу пути ответа на повреждение ДНК (DDR). Мы показываем, что ключевой нонсенс-опосредованный экзон переключения распада РНК (NSE) в ATM репрессируется U2AF, PUF60 и hnRNPA1. Активация NSE была специфичной для гаплотипа и больше всего стимулировалась цитозином по адресу rs609261 в 3'-сайте сплайсинга NSE (3'ss), который преобладает в популяциях с высоким риском развития рака. Уровни NSE нарушались при лейкозах, и на них влияла идентичность остатка 34 U2AF35. Мы также идентифицируем олигонуклеотиды переключения сплайсинга (SSO), которые используют конкуренцию соседних псевдоэкзонов для модуляции уровней NSE. Использование экзонов, регулируемых U2AF, в сигнальном пути ATM было сосредоточено на оси MRN/ATM-CHEK2-CDC25-cdc2/cyclin-B и преимущественно включало транскрипты, участвующие в слияниях генов, связанных с раком, и хромосомных транслокациях. Эти результаты выявляют важные связи между контролем 3ss и ATM-зависимыми ответами на двухцепочечные разрывы ДНК, демонстрируют функциональную пластичность интронных вариантов и иллюстрируют универсальность интронных SSO, которые нацелены на псевдо-3ss для модификации экспрессии генов.

Интроны удаляются с помощью большого и высокодинамичного комплекса РНК-белок, называемого сплайсосомой, который управляет сложными взаимодействиями между первичными транскриптами, малыми ядерными РНК (мяРНК) и большим количеством белков1. Сплайсосомы собираются ad hoc на каждом интроне упорядоченным образом, начиная с распознавания 5'-сайта сплайсинга (5'ss) мяРНК U1 или 3'ss путем U2 пути1,2, что включает связывание вспомогательного фактора U2 ( U2AF) к области 3s для облегчения распознавания U2 последовательности точки ветвления (BPS)3. U2AF представляет собой стабильный гетеродимер, состоящий из субъединицы массой 65 кДа, кодируемой U2AF2 (U2AF65), которая связывает полипиримидиновый тракт (PPT), и субъединицы массой 35 кДа, кодируемой U2AF1 (U2AF35), которая взаимодействует с высококонсервативными динуклеотидами AG в положении 3'. ss и стабилизирует связывание U2AF654. В дополнение к единице BPS/PPT и 3'ss/5'ss, точный сплайсинг требует вспомогательных последовательностей или структур, которые активируют или подавляют распознавание сайта сплайсинга, известных как интронные или экзонные энхансеры или сайленсеры сплайсинга. Эти элементы позволяют распознавать подлинные сайты сплайсинга среди огромного избытка загадочных или псевдосайтов в геноме высших эукариот, которые имеют сходные последовательности, но на порядок превосходят количество аутентичных сайтов5. Хотя они часто обладают регуляторной функцией6, молекулярные механизмы их репрессии плохо изучены.

Исследования секвенирования экзома выявили ограниченный характер соматических мутаций в U2AF1/U2AF2 и других генах, участвующих в распознавании 3ss в раковых клетках, включая SF3B1, ZRSR2, SF1, SF3A1, PRPF40B и SRSF2 (обзор 7). Эти гены кодируют продукты, которые часто взаимодействуют во время сборки сплайсосомы8,9,10 и демонстрируют высокую степень взаимного исключения мутаций, связанных с раком7, что указывает на существование общего онкогенного пути. Профилирование транскриптома при лейкозах, несущих эти мутации, выявило многочисленные изменения в сплайсинге предшественников мРНК7, но ключевые связи между специфическими дефектами процессинга РНК и инициированием или прогрессированием рака остаются неясными, несмотря на большие перспективы этих мишеней для терапевтической модуляции. Кроме того, было неясно, почему сильно ограниченный паттерн мутаций в этих клетках не связан с ограниченным и четко определенным набором дефектов процессинга РНК с онкогенными свойствами. Более того, использование экзонов в генах DDR, критически важных игроках в злокачественной трансформации, не было полностью охарактеризовано в клетках, лишенных факторов процессинга 3ss, а природные варианты ДНК, влияющие на их активацию, неизвестны.

TAG>AAG>GAG hierarchy of exon inclusion levels at the 3′ss consensus15. To confirm that the NSE usage is allele-specific, we examined splicing of two reporter constructs that contained C or T at this position following transient transfections into HEK293 cells (Fig. 2b). As expected, the T construct yielded lower NSE inclusion than the C reporter, both in untreated cells and cells individually depleted of each U2AF subunit (Fig. 2c)./p>G13. We noticed that this mutation activated the NSE 3′ss while repressing its 5’ss and promoting a downstream 5’ss instead, introducing a 112-nt cryptic exon in the mRNA13. We also noticed that within this exon, there was a strong 3′ss consensus preceded by optimal BPS/PPT motifs, which may bind U2AF and activate a smaller, 24-nt pseudoexon (termed PE; Fig. 4a). Examination of published RNA crosslinking/immunoprecipitation data20 in ATM showed U2AF65 binding upstream and downstream of NSE and upstream of PE, suggesting that NSE activation may be controlled by competition between partially productive spliceosomes assembled at the PE 3′ss and the NSE 3′ss. The two 3′ss are conserved in mammals and are separated by a distance smaller than the minimal intron size, sterically preventing simultaneous recognition of NSE and PE (Fig. 4a). Deletion of the PE PPT/3′ss introduced in the C minigene, which should alleviate NSE repression through diminished U2AF binding to PE, increased NSE inclusion (Fig. 4b), in agreement with the 3′ss competition. This deletion also induced retention of the intron that separates NSE and PE, mimicking the splicing pattern of the A-T mutation IVS28-159A >G. Increasing the intron length from 59 to 79 nt, thereby overcoming a steric hindrance imposed by the insufficient distance between the two pseudo-3′ss, also improved NSE inclusion and diminished the intron retention (Fig. 4b)./p>G substitution13. In this A-T case, both NSE and PE were included in the ATM mRNA together with the intervening sequence. Canonical and aberrant transcripts are denoted by dotted lines above and below the pre-mRNA. Middle panel shows RNA-Seq read densities for NSE in cells depleted of both U2AF35 isoforms (ab-) together with U2AF65 tags/high-confidence binding sites (horizontal lines/rectangles) identified by crosslinking and immunoprecipitation20. The 100 basewise vertebrate conservation by Phylop (100 VC) is at the bottom. The lower panel shows mutations (in red and underlined) introduced in the C-minigene. (b) Splicing pattern of wildtype and mutated C minigenes. Mutations are at the bottom of panel (a); RNA products are shown schematically to the right. The largest product produced by clone PE delPPT/AG includes the shortened pseudointron. (c) Splicing pattern of C minigenes mutated in NSE (lanes 2, 3, 7 and 8) or PE (lanes 4, 5, 9 and 10) in (mock)-depleted HEK293 cells. Mutations are at the bottom; their sequences are in Table S2. Spliced products are schematically shown to the right. A hairpin symbol above PE denotes the MIR stem-loop insertion; cr3’ss, a cryptic 3’ss activation 7 nt downstream of the authentic NSE 3’ss. (d,e) SSO-induced pseudoexon switching. Transfected minigenes are shown at the top, spliced products to the right and SSOs at the bottom. SSO sequences are in Table S1. Final concentration of SSOs shown in panels (d–g) was 3, 10 and 30 nM. (f) PE SSOs induced NSE skipping. (g) SSOs targeting a sequence that activates NSE upon deletion (PEdelPPT/AG; panel a and b) inhibit PE. (h) NSE activation is haplotype-dependent. Minigene haplotypes at the indicated variants are at the bottom. Columns represent mean NSE inclusion, error bars are SDs, asterisks denote statistically significant differences as in Fig. 1b./p>TG > TA./p>G62, despite targeting U2AF binding sites (Fig. 4a). This suggests that the morpholino blocked access to structures or motifs that are not responsible for exon activation, but exon repression, in agreement with our finding (Fig. 1a–c). Thus, administration of antisense-based RNA processing activators or inhibitors that target or avoid binding sites of splicing factors in introns could be exploited therapeutically to shape beneficial or detrimental consequences of NMD in cancer cells./p>